人血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)检测试剂盒

产品货号：

ZN2496

中文名称：

人血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)检测试剂盒

英文名称：

Human Vascular endothelial growth factor receptor 3 ELISA Kit

产品规格：

96T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法，用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中VEGFR3的含量。

检测原理

预先包被的抗体为VEGFR3单克隆抗体。检测相抗体也是VEGFR3单克隆抗体，经生物素标记，克隆号54733。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的VEGFR3呈正相关。

背景资料

VEGFR1(Flt-1),VEGFR2(KDR/Flk-1),VEGFR3(Flt-4)都属于受体酪氨酸激酶（RTKs）家族第三亚族。VEGFR1，2，3几乎都在内皮细胞上表达，这些受体在血管增生和血管形成过程中起基本作用。VEGFR3的前体有1298个氨基酸。成熟形态包括751个氨基酸的细胞外部分，22个氨基酸的跨膜区和482个氨基酸的细胞内部分。VEGF-C和VEGF-D都能结合并激活VEGFR3。VEGFR3对淋巴管的形成有重要作用。

基本参数

检测指标：VEGF-R3；VEGFR-3；VEGFR3；VEGF受体3；Flt-4；Flt4
检测范围：156pg/ml～10000pg/ml
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性：＜10pg/ml

产品组成

组分	规格	数量
预包被抗人VEGFR3抗体的96孔板	96T	1板
重组人VEGFR3标准品(冻干)	10ng/管	2管
生物素标记抗人VEGFR3(100X)	100μL	1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X)	100μL	1管
样品稀释液	30mL	1瓶
抗体稀释液	12mL	1瓶
ABC稀释液	12mL	1瓶
TMB显色液	10mL	1瓶
终止液	10mL	1瓶
洗涤缓冲液(25X)	20mL	1瓶
封板膜		4张

保存：2～8℃，有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。

自备器材

标准规格酶标仪。
自动洗板机。
恒温箱
系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
干净的试管和Eppendof管。
用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与我司联系。
用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1～2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。

细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心1000×g 15分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆：采用肝素或EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。
悬浮细胞：离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000～14000g离心3～5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案，以下方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

高：指待测因子在100～1000ng/ml。按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
中：指待测因子在10～100ng/ml。按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
低：指待测因子在156–10,000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
特低：指待测因子≤156pg/ml。样品一般不做稀释，或按1:2稀释。

VEGFR3标准品的稀释和使用。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
- 配制10ng/ml标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
- 配制5ng/ml～0.156ng/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3mL样品稀释液，分别标记上5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml，0.313ng/ml，0.156ng/ml。取0.3mL 10ng/ml的标准品加入标记5ng/ml的管中，混匀后同样取出0.3mL，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
  注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用，但不得反复冻融。
生物素标记抗人VEGFR3抗体工作液。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100～200μL）。
- 按1μL生物素标记抗人VEGFR3加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
- 根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100～200μL）。
- 按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。

确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
将10,000pg/ml，5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
将准备好的生物素抗人VEGFR3抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。
酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应15～20分钟。
注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔差别不明显。
按每孔100μL依次加入终止液，此时蓝色立转黄色。
用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
TMB 37℃反应15～20分钟。
加入终止液，读数。

取自某些批次质检数据，仅供参考，用户需要自己建立标准曲线。

浓度(pg/ml)	0	156	312	625	1250	2500	5000	10000
OD值	0.053	0.486	0.810	1.194	1.479	1.789	1.954	2.206

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